Estudiamos experimentalmente el carácter antimicrobiano de los pimientos

En la clase de esta mañana dedicada al proyecto hemos iniciado los experimentos para estudiar el posible carácter inhibidor de los extractos de pimiento. Previamente habíamos preparado el material microbiológico, como comentábamos en la entrada anterior. Los cultivos de las bacterias de prueba se habían dejado inoculados desde el viernes. La técnica que vamos a emplear se denomina difusión en disco y se lleva a cabo impregnando discos de papel de filtro estériles con los extractos y disponiéndolos sobre cultivos bacterianos en medio sólido.

Hemos trabajado en distintos equipos. En uno de ellos hemos preparado los cultivos bacterianos sobre los que probar los extractos. Partíamos de placas de Petri con medio TSA (triptona-soja-agar) y de tubos con 5 ml de agar semisólido ( medio TSB + agar 0,6%). Estos se han calentado al baño maría hasta que se ha fundido el agar, después se ha dejado que la temperatura baje hasta unos 42-45ºC y se han inoculado con 100 microlitros de los distintos cultivos a ensayar; tras mezclar bien se han vertido sobre las placas y se han dejado solidificar. Las bacterias de prueba son: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Xanthomonas, Dickeya y Ralstonia.

El otro equipo ha preparado los discos con los extractos. Los discos de papel de filtro estériles se han dispuesto sobre una rejilla de plástico que ha estado sumergida en etanol durante varios días. Tras evaporarse el alcohol se han dispuesto sobre ella los discos de papel de filtro y se han impregnado con los extractos. En primer lugar se han añadido 10 microlitros y una vez seco el líquido añadido se ha procedido a añadir otros 10 microlitros más. En cada disco hay, por tanto, 20 microlitros de cada extracto. Los discos se han espaciado regularmente en las placas. A cada placa se ha añadido un disco al que, siguiendo el mismo protocolo, se le han añadido 20 μl de etanol al 70%, el medio que utilizamos para la extracción.

 

Seguidamente se ha procedido a estudiar el carácter inhibidor de la capsaicina, la sustancia responsable del picor de los pimientos. El procedimiento seguido ha sido el mismo que se ha indicado antes. En lugar de los extractos de pimientos se han colocado 20 microlitros de soluciones de capsaicina a las siguientes concentraciones: 1 mM, 500 μM, 200 μM, 100 μM, 50 μM y 10 μM. Se han ensayado con los mismos microorganismos.

Si alguna de las sustancias que estudiamos tienen carácter inhibidor, observaremos alrededor de los discos una ausencia de crecimiento de la bacteria indicadora. Dicho de otro modo, la técnica permite que las bacterias crezcan formando un césped uniforme en toda la extensión de la placa menos donde haya algo que impida el desarrollo de las bacterias. Ahora es necesario que a lo largo de los próximos días valoremos la aparición de estos halos de inhibición. Deberemos medir su extensión para estimar diferencias en la capacidad inhibidora, en el caso de que tengamos resultados positivos.