El próximo experimento que vamos a hacer en nuestro proyecto es estudiar si las variedades de pimientos que utilizamos contienen sustancias capaces de inhibir el crecimiento de los microorganismos. Para ello es recomendable que conozcamos previamente cómo llevar a cabo las técnicas que vamos a aplicar. En esencia lo que vamos a hacer es estudiar si una determinada cantidad de nuestro extracto impide que una bacteria se desarrolle en un cultivo. Para ello extenderemos un cultivo de bacterias sobre una placa de Petri sobre el que colocaremos discos de papel de filtro impregnados con los extractos a ensayar. En el caso de que alguno de nuestros pimientos contenga sustancias antimicrobianas, están difundirán impidiendo el crecimiento de las bacterias y mostrando un halo de inhibición alrededor del disco. Valoraremos la actividad en función de la extensión de este halo.
Las bacterias frente a las que vamos a comprobar el posible carácter inhibidor del crecimiento son: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Xanthomonas, Dickeya y Ralstonia. Las tres últimas son patógenas de plantas, es decir, causan afecciones a las plantas aunque no nos afectan a los seres humanos. Las dos primeras, B. subtilis y E. coli, difieren en la estructura de su pared celular, lo cual tiene importancia en la respuesta de las bacterias ante determinados antibióticos. Partiremos de cultivos en fase estacionaria.
El primer paso es obtener un cultivo en césped de microorganismos. Para ello prepararemos tubos estériles con 5 ml de agar semisólido que mantendremos líquido a una temperatura de 42ºC. Se inocularán con 100 μl de los cultivos de microorganismo con la ayuda de una micropipeta. Tras mezclarlo bien, se verterá sobre una placa de Petri procurando, antes que solidifique, extenderlo uniformemente. De esta manera, las bacterias creceran por toda su extensión.
Prepararemos a continuación los discos de papel de filtro con los extractos de pimiento. Para ello colocaremos los discos de papel previamente esterilizados sobre una rejilla de plástico que habremos matenido sumergida en etanol, una vez evaporado éste. Impregnaremos los discos con 10 μl de cada extracto con la ayuda de una micropipeta y lo dejaremos secar para volver a añadir otros 10 μl. De esta manera conseguiremos aumentar la concentración del extracto.
Una vez secos los discos se colocarán regularmente espaciados sobre el agar inoculado. El contenido de cada disco deberá estar debidamente identificado, para lo cual habremos marcado previamente sobre la placa algún identificador.
Con el mismo procedimiento vamos a valorar si la capsaicina, el componente que le da el sabor picante típico al pimiento, tiene capacidad antimicrobiana. En lugar de los extractos de pimientos añadiremos sobre los discos el mismo volumen de capsaicina a distintas concentraciones. En ambos casos valoraremos el posible efecto inhibidor por la aparición y la extensión de los halos de inhibición alrededor de los discos con los extractos.
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